A diminuição do fluxo cardíaco esquerdo em cordeiros fetais causa hipoplasia do coração esquerdo e pro

Biologia das Comunicações, volume 6, número do artigo: 770 (2023) Citar este artigo

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O baixo fluxo sanguíneo através do coração esquerdo fetal é frequentemente conjecturado como uma etiologia da síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE). Para investigar se uma diminuição no fluxo cardíaco esquerdo resulta em falha de crescimento, geramos obstrução do fluxo ventricular esquerdo (LVIO) em cordeiros fetais no meio da gestação, implantando bobinas no átrio esquerdo usando uma técnica percutânea guiada por ultrassom. O LVIO significativo recapitula características clínicas importantes da SHCE: diminuição do fluxo da válvula aórtica anterógrada, perfusão retrógrada compensatória do cérebro e da aorta ascendente (AAo) do ducto arterial, hipoplasia grave do coração esquerdo, VE sem formação de ápice e camada endocárdica espessada. Os AAo hipoplásicos possuem pares de genes miRNA que anotam a proliferação celular que são inversamente expressos diferencialmente por RNA-seq em massa. O RNA-seq de núcleo único do miocárdio hipoplásico do VE mostra um aumento nos fibroblastos com uma diminuição recíproca nas proporções dos núcleos dos cardiomiócitos. Fibroblastos, cardiomiócitos e células endoteliais do miocárdio hipoplásico apresentam expressão aumentada de componentes da matriz extracelular ou genes de fibrose com sinalização desregulada do fator de crescimento de fibroblastos. Conseqüentemente, uma redução grave e sustentada (~ 1/3 da gestação) no fluxo cardíaco esquerdo fetal é suficiente para causar hipoplasia do coração esquerdo. Isto é acompanhado por alterações na composição celular e na expressão genética consistentes com um ambiente pró-fibrótico e indução aberrante de programas mesenquimais.

A hipoplasia do ventrículo esquerdo (VE) é um componente de muitas formas de doença cardíaca congênita. Na sua forma mais grave, a síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE), todas as estruturas do coração esquerdo são diminutas e não conseguem suportar a circulação sistémica. Apesar da cirurgia reconstrutiva, os resultados clínicos para SHCE não são ideais: sobrevivência de 64% ou 74% em 1 ano1 e 59% ou 64% em 6 anos2, dependendo do tipo de cirurgia. Apenas cerca de 50% dos pacientes com SHCE atingem os 18 anos de idade e no início da idade adulta enfrentam múltiplos desafios, incluindo insuficiência cardíaca3.

A etiologia da hipoplasia do VE permanece incerta e provavelmente será heterogênea. Em alguns fetos, a hipoplasia do VE pode tornar-se aparente após a conclusão da cardiogênese, marcada pelo fechamento do septo ventricular às 9,1 semanas de gestação humana (estágio Carnegie 22). No contexto específico da SHCE, um início pós-cardiogênese de falência do crescimento do VE é apoiado pela observação de que um septo ventricular intacto é encontrado no padrão anatômico mais comum da SHCE (estenose ou atresia das valvas aórtica e/ou mitral)4, 5,6, e que a progressão da estenose aórtica fetal grave para SHCE tem sido repetidamente documentada no segundo ou terceiro trimestre de gravidez7. A consequência hemodinâmica do fechamento do septo ventricular é que o enchimento fetal do VE se torna mais precário: é inteiramente dependente do fluxo através da válvula atrioventricular esquerda e não pode mais ser compensado pelo fluxo através do septo ventricular.

Foi levantada a hipótese de que as forças hemodinâmicas desempenham um papel na etiologia da SHCE e modelos animais demonstraram que o fluxo sanguíneo afeta o desenvolvimento e o crescimento das estruturas cardiovasculares. Uma diminuição de 70% no fluxo da artéria carótida de coelhos durante 2 semanas resultou em uma diminuição do diâmetro dependente do endotélio que foi resistente à vasodilatação8. Em embriões de peixe-zebra, a entrada ou saída ventricular teve efeitos profundos na morfogênese do coração, incluindo formação de válvulas e diferenciação de câmaras; uma falha de crescimento distal foi atribuída a menores forças de cisalhamento nas células endocárdicas9. Nos primeiros embriões de galinha, a ligadura unilateral da veia vitelina resultou em malformações estruturais das artérias do arco faríngeo e do coração10,11,12. O defeito cardíaco resultante, mais comumente uma anormalidade do septo ventricular ou das válvulas semilunares, dependia da extensão da redução do fluxo13. Em embriões de pintinhos mais velhos após a cardiogênese, a obstrução do influxo do coração esquerdo resultou na diminuição do crescimento do coração14.

0.88 for AAo and >0.91 for LV). We also noticed between-sample variation, which may outweigh effects from the coiling for some samples (Fig. S6) and may be related to some samples having low RNA integrity numbers (RIN). After removing outliers, we identified 64 significantly upregulated, and 85 downregulated genes in AAo (Figure S7a; upregulation refers to higher expression in coiled fetuses). Pathway analyses of significantly differentially expressed genes revealed enrichment for cellular components of the cell periphery (p = 0.022) and plasma membrane (p = 0.029; Supplementary Data 1). Additionally, we identified 4 upregulated miRNAs in AAo (Fig. S8a). For three of those miRNAs, we found significantly downregulated target genes (Fig. S8b), including genes involved in cell growth and proliferation (DDIT4, HS6ST2) and cell adhesion (NRXN3, IGFS3, HS6ST2). For the LV, we discovered 4 significantly upregulated, and 13 downregulated genes (Fig. S7b), enriched for brown fat cell differentiation processes. We also identified 4 upregulated and 7 downregulated miRNAs (Fig. S9a). Among the top upregulated miRNAs was miR-15a-5p. In mice, overexpression of miR‐15 family members was associated with cardiomyocyte cell cycle withdrawal and smaller heart size33. Two upregulated miRNAs had significantly downregulated target genes, and three downregulated miRNAs had significantly upregulated target genes (Fig. S9b). Additional “novel” miRNAs in AAo and LV could not be matched with their respective orthologues and were therefore not evaluated. While the low RIN values necessitate cautious interpretations, we found differentially expressed miRNAs and target genes associated with cell growth, proliferation and adhesion. However, we could not attribute changes to specific cell types or biological pathways./p>

1 and false discovery rate (FDR)-adjusted p-value < 0.05). Briefly, small RNA-seq reads had adapter sequences trimmed with the BBMap suite to keep reads with fewer than 23 nucleotides after trimming. Reads were aligned to the OviAri4 genome and Oar_v4.0 annotation using miRDeep2./p> 1, FDR-adjusted p-value < 0.05; Supplementary Data 1) for treatment – control within each tissue using DESeq2 (v 1.30.1)63. Shrunken log2FCs were calculated with “normal” shrinkage estimator. Mature sequences of DE novel miRNAs were used to identify known miRNA homologs based on sequence similarity in other species with “Single sequence search” function on miRBase (v22.1) with SSEARCH search method./p>

5 and UMAP_2 < 6. We measured pseudotime trajectories with Slingshot74, with stretch = 0 and extension = “n”. We used clusters 10, 2, and 15 as the start clusters for the cardiomyocyte, fibroblast, and endothelial clusters, respectively. First, we removed genes that were not designated with a gene symbol. We then used the tradeSeq75 package to estimate the minimum number of appropriate knots with the “evaluateK”75 function before fitting a negative-binomial general additive model (nb-GAM) for each gene with the “fitGAM”75 function. The 5,000 most variable genes also had nb-GAM’s fitted in each condition to allow for differences in expression between conditions along pseudotime. We identified genes whose expression is associated with pseudotime using the “associationTest” function75, and genes that were differentially expressed between conditions using the “conditionTest”. We corrected p-values returned with these functions using a false-discovery rate (cut-off: FDR-adjusted p-value < 0.05). We then generated pseudotime heatmaps of associated and differentially expressed genes by predicting smoothers for each gene using the “predictSmooth”75 function. Smoothers were scaled and then plotted with the pheatmap function. We completed pathway enrichment of these associated and differentially expressed genes using the following command:76 gprofiler(genes,”hsapiens”, ordered = TRUE, src_filter = c(“GO:BP”, “REAC”, “KEGG”), custom_bg = detected_genes, correction_method = “fdr”)77 and plotted with ggplot2./p>

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